Urodzony 19 marca 1542 r. w Skokówce, studiował w Paryżu, Strasburgu i Padwie, gdzie w 1563 r. pełnił funkcję rektora uniwersytetu, w tym samym roku publikując w Wenecji pracę naukową De senatu Romano. Po powrocie do kraju, w 1565 r. mianowany został sekretarzem królewskim. W czasie pierwszej wolnej elekcji stał się jednym z przywódców średniej szlachty w walce z magnaterią, opowiadając się za elekcją viritim. Wkrótce doszedł do wysokich godności państwowych: w 1576 r. został podkanclerzym, dwa lata później kanclerzem koronnym, w 1581 hetmanem wielkim koronnym. Niechętny Habsburgom, opowiedział się za elekcją Anny Jagiellonki, która zobowiązała się do poślubienia Stefana Batorego. Najbliższy doradca Batorego, kierując polityką wewnętrzną i zagraniczną zwalczał warcholstwo Zborowskich, przyczyniając się do skazania S. Zborowskiego, dążąc do wzmocnienia władzy królewskiej. W latach 1580-1581 brał udział w wojnie z Moskwą, po śmierci Batorego (1586) poparł Zygmunta III Wazę; na wieść o tajnych układach króla z Habsburgami Zamoyski doprowadził na sejmie inkwizycyjnym 1592 r. do wyrzeczenia się przez Zygmunta III planów ustąpienia z tronu polskiego. Groźba wojny z Turcją skłoniła go do przedstawienia na sejmie 1590 r. projektu opanowania Wołoszczyzny i przeniesienia linii obrony nad Dunaj. W 1600 r. zbrojnie sparaliżował próbę Michała Walecznego zjednoczenia Wołoszczyzny i Mołdawii, osadzając przejściowo, jako lennika polskiego na tronie pierwszej ziemi Szymona Mohyłę, a w Mołdawii Jeremiego Mohyłę. W 1601 r. objął dowództwo nad armią walczącą w Inflantach ze Szwedami. Dostrzegając dążenia Zygmunta III do wzmocnienia władzy królewskiej, w przeddzień sejmu 1605 r. stanął na czele opozycji, która po jego śmierci (Zamość, 3 VI 1605 r.) miała się rozwinąć w rokosz Zebrzydowskiego. Na sejmie 1605 r. występował przeciw popieraniu Dymitra Samozwańca I, pragnął doprowadzić do zgody z królem za cenę pewnych ustępstw (rezygnacja z projektów małżeństwa króla z Konstancją Habsburżanką), król zignorował jednak te próby. Poglądy na sprawy reformy wewnętrznej państwa zawarł Zamoyski w słynnej mowie sejmowej z 1605 r. Mecenas humanistów, założyciel Zamościa i fundator Akademii Zamojskiej, podnosił znaczenie nauki dla rozwoju społeczeństw, pozostawał w bliskich stosunkach z wybitnymi pisarzami epoki, wielu z nich patronując (m.in. Sz. Szymonowicowi, A. Nideckiemu, S. Reszce, R. Heidensteinowi); skompletował cenny księgozbiór własny i ufundował bibliotekę akademicką.